La chromatographie sur couche mince

Le Principe l'hydrodistillation

Extraction des colorants du sirop de menthe

Utilisation d'un spectrophotomètre

Définition et appareillage.

La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.

Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont :

– la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.

– la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l’amidon ou un polymère organique.

– l’échantillon : environ un microlitre (ml) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.

– l’éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon.

Le spectromètre

C’est un appareil mesurant la quantité de lumière absorbée ou bien transmise par une solution, pour des longueurs d’onde (l) données. Revoir les généralités sur la lumière dans le cours de physique !

Ici nous mesurons la valeur de l’ « absorption » appelée plus précisément absorbance, notée A qui est définie par :

A = log10 (I0/Is)

avec I0 = intensité lumineuse du faisceau à l’entrée de la cuve et Is son intensité à la sortie de la cuve

A n’a pas d’unité.

Parmi les techniques d’extraction d’une huile essentielle, l’hydrodistillation ou entraînement à le vapeur est l’une des plus anciennes (remonte à l’Antiquité). Elle est très facile à mettre en œuvre. Le principe est le suivant : dans un ballon, on porte à ébullition un mélange d’eau et de la plante dont on souhaite extraire l’huile essentielle. Les cellules végétales éclatent et libèrent les molécules odorantes, lesquelles sont alorsentraînées par la vapeur d’eau créée. Elles passent par un réfrigérant à eau où elles sont condensées, puis sont récupérées dans un récipient.
car on pense que les Perses l’auraient
découvert pour fabriquer l’eau de rose.

TP titrage pH métrique

Le titrage pH-métrique:
Le titrage pH-métrique:

Ce titrage est basé sur une réaction acido-basique entre le réactif titrant et le réactif titré.
Pour déterminer l'équivalence, on peut utiliser deux méthodes:
Utilisation d'un indicateur coloré :
Quelques gouttes d'indicateur coloré sont ajoutées dans le bécher contenant le réactif titré ; à l'équivalence
il se produit un changement de couleur.
Mesures du pH :
On mesure le pH du milieu réactionnel au fur et à mesure de l'ajout du réactif titrant, on trace alors la
courbe donnant les variations du pH. À partir de cette courbe, on détermine l'équivalence. C'est cette
méthode qui sera utilisée lors de ce TP.

Mode opératoire

Verser, dans un ballon, 3 brins de laine écrus de 20 cm de longueur , environ 20 mL de sirop de menthe,

5 mL d’une solution d’acide éthanoïque à 2 mol.L-1

Porter à ébullition douce pendant 10 min : la laine prend une intense couleur verte alors que la solution devient bleu clair (surveiller pour éviter une forte ébullition et ne pas laisser caraméliser les sucres).
Rincer abondamment à l’eau pour éliminer les sucres : les colorants sont fixés sur la laine.
Mettre la laine dans un bécher contenant 15 mL d’une solution d’ammoniac à 0,10 mol.L-1 et porter l’ensemble à nouveau à ébullition douce : la solution prend rapidement la couleur verte du sirop.
Retirer la laine, laisser bouillir quelques instants pour concentrer la solution par évaporation de l’eau.

Les principales techniques de dosage par étalonnage
Les principales techniques utilisées pour réaliser un dosage par étalonnage sont la spectrophotométrie et la conductimétrie.
La spectrophotomètrie
Le spectrophotomètre mesure l'absorbance (A) d'une solution pour une longueur d'onde donnée. Elle varie en fonction de la concentration en suivant la loi de Beer-Lambert: A = k x C. Cette formule indique une relation linéaire entre l'absorbance et la concentration ce qui implique que la courbe d'étalonnage est une droite et peut donc être tracée avec un nombre limité de points.
La conductimétrie
Le conductimètre mesure la conductivité ( σ ) d'une solution. Elle varie en fonction de la concentration suivant la loi de Kohlraush: σ = k' x C. Il s'agit également d'une relation linéaire qui aboutit à une courbe d'étalonnage correspondant à une droite.

Les principales techniques de dosage par étalonnage

La Chromatographie sur Colonne

Principe

On utilise une colonne en verre équipée d'un verre fritté et d'un robinet. La colonne est remplie d'une poudre, généralement de l'alumine ou de la silice, ou une résine échangeuse d'ions. Un mélange est placé en haut de la colonne. Selon la nature de l'éluant et du contenu de la colonne, certaines molécules sont plus facilement éluées

que d'autres.

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mit au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.

Ainsi, les scientifiques peuvent distinguer les bactéries à Gram positif, dotées d'une simple paroi avec une grande quantité de peptidoglycane, des bactéries à Gram négatif, composées de moins de peptidoglycane mais pourvues d'une membrane externe supplémentaire. Ce type de classification n'est pas sans conséquence dans le domaine médical (la résistance des bactéries et l'efficacité d'antibiotiques dépendant du type de bactérie).

Une boîte de Pétri est une boîte en plastique dans laquelle vous allez cultiver vos bactéries.
Pour se faire, vous devez ensemencer ce milieu, c'est-à-dire y déposer des bactéries qui s'y développeront par la suite. Pour réussir cette ensemencement, vous pouvez utiliser la technique des stries.
Elle permet d'obtenir des colonies pures (composées d'un seul type de bactéries) et isolées les unes des autres. Cela vous permettra ainsi de déterminer les différentes bactéries présentes dans l'échantillon analyser.

La coloration de GRM

Ensemencement sur boite de petri

Préparation milieu de culture

Un milieu de culture doit satisfaire à toutes les exigences nutritives des micro-organismes : - apport de la source d'énergie, de carbone, d'azote; - besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance; - pH et force ionique voisins des valeurs optimum. Il peut se présenter sous forme liquide ou solide, par addition : - d'aqar ou gélose (intérêt : fusion au delà de 80°C, mais possibilité de le maintenir en surfusion à 45°C, température compatible avec l'incorporation de micro-organismes ; pas d'hydrolyse de l'agar par les µ-org), C'est un polymère sulfaté composé de D- et L-galactose. Il est produit par les Rhodophycées (algues rouges) - de gélatine (hydrolysable par certains germes, utilisation historique), - oeuf entier coagulé (milieu de Jensen pour Mycobactéries). - Gel de silice, utilisé pour la croissance des bactéries autotrophes sur milieu solide(si on veut exclure toute molécule organique).